Pythium属菌の分類−形態分類から分子分類まで

岐阜大学流域圏科学研究センター　

植生資源研究部門植生管理研究分野

景 山 幸 二

kageyama@green.gifu-u.ac.jp

1. 分類の歴史

・ Matthew, V. P. (1931) Studies on the genus Pythium. Chapel Hill, NC., USA: University of North Calolina Press, pp.1-136.

・ Sideris, C. P. (1932) Taxonomic studies in the family Pythiaceae. 2. Pythium. Mycologia 24: 14-61.　

・ Middleton, J. T. (1943) The taxonomy, host range and geographic distribution of the genus Pythium. Memoirs of Torrey Bot. Club 20: 1-171.　

・ Waterhouse, G. E. (1967) Key to Pythium Pringshem. Commonw. Mycol. Inst. Kew, Mycol. Paper No. 109

・ Waterhouse, G. E. (1968) The genus Pythium Pringshem. Commonw. Mycol. Inst., Mycol. Paper No. 110.

・ Hendrix, F. F. Jr. and Papa, K. E. (1974) Taxonomy and genetics of Pythium. Proc. Am. Phytopathol. Soc. 1: 200-207.

・ Van der Plaats-Niterink, A. J. (1981) Monograph of the genus Pythium. Studies in Mycology. 21: 1-142.

・ Dick, M. W. (1990) Key to Pythium. 64pp. Reading U.K.: published by the author, ISBN 0704904144.

2. 形態による分類

Ø 培養法： Grass blade culture　(Waterhouse, 1967）

ＣＭＡ培地上でオートクレーブした芝草の葉（１mm程度に切ったもの）に供試菌株を感染させ、滅菌水（池水１：蒸留水２を混合しろ過したもの）の入った９ｃｍシャーレに移して２０℃あるいは２５℃で培養する。倒立顕微鏡で毎日観察する。

雌雄異株性を調べるための対峙培養用培地は、CMA（トウモロコシをミールにして煮出して作った自作のＣＭＡ培地）を使用する。　※菌株保存にも自作CMA斜面培地がよい

Ø 形態的特徴

�@ 雌雄異株性・同株性 −　７種（P. catenulatum, P. flevoense, P. hetorothallicum, P. intermedium, P. macrosporum, P. splendens, P. sylvaticum）が雌雄異株性

�A 無性繁殖器官　− 胞子のう（糸状、膨潤状、球形、胞子のうの増殖性）

�B 有性繁殖器官　− 蔵卵器（表面平滑、棘有り）、蔵精器（同菌糸性、異菌糸性、直下性）、卵胞子（蔵卵器内で充満、非充満）

�C 培養形態　−　ＣＭＡ、ＰＤＡあるいはＰＣＡ上での生育状況

Ø 温度反応

ＣＭＡあるいはＰＣＡ上での各種温度における生育速度

3. Phytophthora属菌との違い

・ 胞子のう内で原形質が分化して遊走子が形成されるのに対し、Pythium属菌では胞子のうの外部に原形質が移動し、薄い膜に覆われた球のう(vesicle)が形成されてその中で遊走子が分化する。

・ 胞子のうには糸状や膨状の胞子のうを形成する種はない。

・ 蔵精器は通常１個蔵卵器につき側着と底着の両方が見られる。Pythium属菌は、１〜数個の蔵精器が蔵卵器につき、側着が主で底着はみられない。

・ 一般にチアミン要求性である。

4. 分子分類

Pythium属菌では、Chen (1992) により３種の雌雄異株性の種を区別するために初めて分子生物学的手法が分類に利用された。それ以降、多くの種について特にｒDNAのITS領域に注目した研究が行われてきた。当初は、ITS領域のPCR産物のRFLP分析による比較であったが(Chen et al., 1992; Wang et al., 1998)、Matumoto et al. (1999)により３０種、２グループの塩基配列にもとづく分子系統樹が作成された。

Ø 分子分類で分かったこと

・ 分子系統樹をみるとPythium属菌が最初に分岐する点は胞子のうの形態の違いのところであり、形態進化学的に無性器官が重要であることが明らかになった（Middletonの分類体系が正しい）。

・ これまで有性器官を対峙培養でも形成しない菌株を同定することができるようになった（Kageyama et al., 1998）。

・ 形態的に類似した種でも明確に同定が出きるようになった。

Ø 分子分類の問題点

・ 基準菌株の入手

・ 塩基配列決定には設備投資と費用が必要

Ø ITS領域利用の問題点

・ 種内変異や菌株内変異が知られている種がある。

・ アライメントの信頼性に疑問があり、他の遺伝子に着目した系統樹と比較する必要があることが指摘されつつある。 ※Martin (2000)は、ミトコンドリアにコードされているシトクロームオキシダーゼ遺伝子に注目し分子系統樹を作成し、その有効性を述べている。

5. これからのPythiumの分類

・ 形態分類に塩基配列に基づくデータを加えた同定(Moorman et al., 2002)、種特異的プライマーを用いたPCR (Kageyama et al., 1997)、Reverse Dot Blot Hybridization (Levesque et al., 1998)、マイクロアレイを用いた簡易同定

参考文献

Chen, W. (1992) Restriction fragment length polymorphism in enzymatically amplified ribosomal DNAs of three heterothallic Pythium species. Phytopathology 82: 1467-1472.

Chen, W. Hoy, J. W. and Schneider, R. W. (1992) Species-specific polymorphism in transcribed ribosomal DNA of five Pythium species. Exp. Mycol. 16: 22-34.

Kageyama, K., Ohyama, A. and Hyakumachi, M. (1997) Detection of Pythium ultimum using polymerase chain reaction with species-specific primers. Plant Dis. 81 :1155-1160.

Kageyama, K., Uchino, H. and Hyakumachi, M. (1998) Characterization of the hyphal swelling group of Pythium: DNA plymorphisms and cultural and morphological characteristics. Plant Dis. 82 :218-222.

Levesque、A C., Harlton, C.E. and de Cock, A. W. A. M. (1998) Identification of some oomycetes by reverse dot blot hybridization. Phytopathology 88: 213-222.

Martin, F. N. (2000) Phylogenetic relationships among some Pythium species inferred from sequence analysis of the mitochondrially encoded cytochrome oxidase II gene. Mycolgia 92: 711-727.

Matsumoto, C., Kageyama, K., Suga, H. and Hyakumachi, M. (1999) Phylogenetic relationships of Pythium species based on ITS and 5.8S sequences of the ribosomal DNA. Mycoscience 40: 321-331. 要注意!!　rDNA-ITSプライマーの塩基配列が違っている

Moorman, G. W., Knag, S., Geiser, S. M. and Kim, S. H. (2002) Identification and characterization of Pythium species associated with greenhouse floral crops in Pennsylvania. Plant Dis. 86: 1227-1231.

Wang, P. H. and White, J. G. (1997) Molecular characterization of Pythium species based on RFLP analysis of the internal transcribed spacer region of ribosomal DNA. Physiol Molecul. Plant Path. 51: 129-143.